华恒生物如何打造核心技术壁垒？

厌氧发酵+酶法催化构建核心技术壁垒.

1.技术平台壁垒体现在多管线工业菌种研发

实现菌种的创制是合成生物企业发展的前提。合成生物技术的创造性意义在于把生 产目标产物的完整代谢通路放入底盘菌，通过不断创造新分子、创建新的代谢通路 以及丰富可异源表达以获得不同化学品种类。例如通过改造大肠杆菌可以获得生产 维生素B12、丁二酸、PHA等产物的工程菌。因此，合成生物行业首先要求企业具备 多管线菌种研发能力，实现工业菌种创制。然而微生物生命系统复杂，细胞内各类 生化反应机制尚未完全破解，工程化改造菌株需要通过多轮设计-构造-检验循环 （Design-Build-Test cycle，DBT循环）才能够找到基因元件的最优组合，再利用产 物积累率、菌种稳定性、抗逆性三大指标进行菌种筛选，对研发设备、人才等要求极 高。这也决定现阶段大多数合成生物生产制造企业主要从科研院所取得初代菌株， 再利用自身多年积累的生产经验进行产业化放大。此外，工程菌株作为合成生物学 产品性能和成本的关键，极易盗取，且难以取证，导致侵权成本低、维权成本高，需 企业建立足够知识产权保护。

2.厌氧发酵平台：代谢路径可延伸，助力产品矩阵内生增长

构建微生物细胞工厂(MCFs)是绿色生物制造的核心环节。通常在选择合适的工程细 胞后，需要通过“设计-构建-测试-学习”的迭代试错流程来重构代谢路径，从而开 发出具有特定功能的 MCFs，以实现底物消耗和目标产物生产的最优化，并且让改 造后的 MCFs 能够适应工业生产环境，满足工业生产需求。研发出满足目标要求的 MCFs具有非常高的技术难度，具体步骤及其难点在于：

（1）设计：需要根据目标功能设计MCFs的代谢路径。微生物代谢及其控制是一个 非线性复杂网络系统，细胞依靠其精巧的基因线路以及严格的调控机制来维持各项 代谢活动的稳定，由于已有生物学知识的局限性，生物系统存在极高的不可预测性， 导致设计的基因线路在实际体系中难以达到理想的目标。根据袁姚梦等人《微生物 细胞工厂的设计构建：从诱变育种到全基因组定制化创制》文献数据，由于生物系 统的复杂性和“生命暗物质”的普遍存在，从MCFs概念设计到满足实际应用，通常 需要 50-300人/年的人力投入及数亿美元的资金投入。

（2）构建：利用基因工程手段进行菌株构建。即使完成了代谢路径的设计步骤，要 获得一个高效的细胞工厂，还需要从物质代谢、能量代谢和细胞生理代谢三方面深 入解析微生物高效合成化学品的代谢调控机制，以提高细胞产量。物质代谢方面， 需要研究元件与合成途径的适配机制，解除限速步骤，避免有毒中间代谢物积累， 使碳代谢流最大程度地流向目标化学品。能量代谢方面，需解析能量对合成代谢的 调控机制，使细胞代谢底物时产生足够的还原力和 ATP去满足化学品合成需求。细 胞生理代谢方面，需阐明细胞耐渗透胁迫机制，提高化学品的产量。

（3）测试：对菌株进行表征，并结合高通量分析或组学分析等手段对目标参数进行 评估并根据分析结果，对模型进行改进。

（4）重复迭代：直至获得满足需求性状的目的MCFs。

据华恒生物募集说明书，公司构建了以可再生葡萄糖为原料厌氧发酵生产 L-丙氨酸的微生物细胞工厂，2012年在世界范围内首次实现了 L-丙氨酸的厌氧发酵生产。L丙氨酸制造主要通过化学合成法，即通过石化路线以石油基化合物为原料合成，由 此带来的生产成本居高不下，环保压力大等因素严重限制了L-丙氨酸的下游应用。通 过代谢工程改造后获得的工程菌可以实现在好氧条件下发酵，具有生产快、产量高 等优势。但好氧发酵工艺中，大量碳源用于生成能量和合成菌体细胞，造成糖酸转 化率低，且持续通气需消耗大量的能源。与好氧发酵工艺相比，厌氧发酵操作简单、 无需通氧、糖酸转化率高且易接近理论最大值，低成本、低耗能、 更加环保，在工 业化生产中优势明显。

厌氧发酵优势明显，但工艺难度大，过往限制其生产应用的因素主要有两个：

（1）能量代谢方面：葡萄糖到氨基酸的代谢途径在厌氧条件下还原力供给不平衡。 大肠杆菌作为合成生物学中常用的工程细胞，天然条件下主要通过转氨酶/谷氨酸脱 氢酶双酶体系生产L-丙氨酸，每生成1 mol L-丙氨酸需要消耗1 mol NADPH，而厌氧 条件下葡萄糖代谢只能提供 NADH，因此会出现还原力供给不平衡问题。针对此问 题，张学礼博士及其研究团队通过在大肠杆菌中引入来自嗜热脂肪芽孢杆菌的 NADH 依赖型L-丙氨酸脱氢酶替代双酶体系成功创建了L-丙氨酸合成的新途径。该 途径中L-丙氨酸脱氢酶直接利用NADH 和铵离子就可以将丙酮酸转化为 L-丙氨酸， 从而成功解决了还原力不平衡的问题。

（2）生产效率方面：厌氧条件下菌种量少，单个细胞合成效率低导致菌种整体生产 性能差。张学礼及其研究团队通过设计代谢进化的技术方案，基于细胞生长和产物 合成偶联来提升单个细胞合成效率，实现了在菌种量少的条件下高效合成目标产物， 具体方法是：首先通过重构大肠杆菌的代谢网络，敲除厌氧混合酸发酵的关键基因 使 L-丙氨酸成为厌氧条件下唯一消耗 NADH 的合成途径。由于 NAD+再生才能让 糖酵解持续运转从而为细胞生长提供能量，因此使细胞生长和 L-丙氨酸合成形成偶 联。以这种偶联为基础，利用代谢进化技术通过在厌氧条件下连续传代积累具有优 势突变的菌株，从而使细胞生长和 L-丙氨酸合成能力逐步提升的菌株得到筛选。最 终获得的高效生产 L-丙氨酸的工程菌合成效率提高了8倍，比生产速率从最初的 0.10 g/(g·h) 提高到了0.79g/(g·h) 细胞干重，菌种生产强度达到3.9 g/(L·h)，糖酸转 化率高达 95%。

L-丙氨酸厌氧发酵技术的成功颠覆了传统氨基酸必需好氧发酵的模式，华恒生物于 2012年实现了全球首次L-丙氨酸的厌氧发酵生产，之后又与张学礼团队在生产中开 发 L-丙氨酸厌氧批式串联发酵工艺。该工艺除了具备传统厌氧发酵糖酸转化率高及 无需耗氧等优势外，还无需使用种子罐，省去种子液制备时间进而使发酵时间大幅 缩短。在此基础上，公司建成年产3万吨国际最大规模的L-丙氨酸发酵生产线并实现 稳定生产，生产成本较化学合成法降低 50%，并可避免二氧化碳排放。

合成生物学平台具有延伸性，可以通过增强、添加、敲低或者敲除某些基因，经由 同一通路调控下游多个物质的合成，当打通某一代谢路径后，理论上后续不同品类 产品生产具有很强的可拓展性。原因是：大肠杆菌内部天然即存在某些代谢产物的 合成途经，如丁二酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸等，通过对大肠杆菌自身的代谢途径进行 适当改造与调控，如解除关键位点的反馈抑制、提高限速酶的表达量、调控辅因子代谢平衡等，将代谢流最大程度地引向目标产品后，即可生成对应产品。对于大肠 杆菌内部不存在或者代谢效率较低的合成途经，可以利用外源基因将代谢途径补充 完整或提高原有代谢途径的效率。例如在大肠杆菌中引入来源于酿酒酵母的甘油-3- 磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸酶以及肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶，即可获得1,3-丙二 醇的代谢路径;引入来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶后可获得L-丙氨酸的代 谢路径。公司掌握菌株构建及发酵技术的核心工艺后，可通过延展或改造代谢路径， 不断延伸公司产品线，强化合成生物学平台优势。目前公司所研发出的生物基L-丙氨 酸、L-缬氨酸、苹果酸、丁二酸等均可通过基因编辑的方式由“葡萄糖—丙酮酸—对 应产物”的代谢路径合成得到，例如：

（1）L-丙氨酸：高产L-丙氨酸的菌株包含三部分改造，一是在大肠杆菌中引入能 够将丙酮酸转化为L-丙氨酸的L-丙氨酸脱氢酶基因；二是敲除丙酮酸竞争途径基 因，从而使代谢流全部转入L-丙氨酸的合成，这些竞争途径包括乳酸脱氢酶基因、 丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙酸激酶基因、乙醇脱氢酶基因、富马酸还原酶基因等； 三是敲除L-丙氨酸降解途径基因，阻碍其转化为D-丙氨酸。

（2）L-缬氨酸：在构建生产L-缬氨酸的大肠杆菌过程中，需要保留丙酮酸向乙酰 乳酸转化的过程，通过向微生物中导入乙酰羟基酸还原异构酶编码基因，还原由丙 酮酸生成的乙酰乳酸，并增强L-缬氨酸发酵菌株的氨基酸脱氢酶活性为还原过程提 供NAPDH，即可形成厌氧生产L-缬氨酸的代谢路径。

（3）苹果酸/丁二酸：生产丁二酸过程中，首先敲低了丙酮酸向乳酸、甲酸、乙酸 的转化途径，同时通过外源酶基因或酶结构改构的方式增强丙酮酸到草酰乙酸、异 柠檬酸向乙醛酸和苹果酸的代谢过程，最终获得丁二酸。

3.酶催化平台：反应温和高效，广泛用于生物合成

酶催化法具有反应速率高、反应条件温和、产品纯度高等特性。具体来说，酶法生产 工艺在酶蛋白的作用下，降低化学反应所需的活化能，从而提高化学反应的速度。 与化学合成法相比，酶法不需要化学合成的高温高压、强酸、强碱、大量的有机溶剂 和贵重的化学催化剂等条件，只需在常温、常压、接近中性的水溶液中进行反应。另 外，由于酶催化的反应具有极高的专一性，它只催化一种物质的一种反应，只产生 一种产物，再加上反应条件温和，因而反应过程中副反应少，生产的效率高。凭借反 应高效、高产品质量等优点，酶催化法被广泛应用于多种化合物的工业合成。

β-丙氨酸

β-丙氨酸是自然界唯一存在的β型氨基酸，与α-丙氨酸互为同分异构体，是合成维生 素 B5、肌肽的重要原材料之一，还可参与维生素泛酸和辅酶A的组成。β-丙氨酸长 期以来主要通过化学合成法进行生产，其中丙烯腈氨化水解法是国内生产β-丙氨酸 的主要方法。通过将丙烯腈和氨水氨化反应生成β-氨基丙腈，再在酸性或者碱性条 件下水解得到β-丙氨酸。该方法虽然成本较低，但是原子转化率低，且水解过程中会 产生大量无机盐，产物提纯难度大。 2016年，公司实现了以 L-天冬氨酸为原料酶法脱羧生产β-丙氨酸。L-天冬氨酸-α-脱 羧酶（PanD）是合成 β-丙氨酸的关键酶，该酶可高效催化含有两个羧基的 L-天冬 氨酸定向脱去一个羧基，并释放一单位CO2，从而获得 β-丙氨酸。虽然该工艺的反 应条件温和，可一步实现 β-丙氨酸的合成；同时避免了使用有机溶剂和副产废盐带 来的环境污染，缩短了工艺路线。但是脱掉的羧基中含有一个未被利用的碳原子， 导致原子经济性较低，产品成本较高。

2018年，公司创造性地构建了以廉价易得的丙烯酸为原料，利用人工合成酶催化生 产 β-丙氨酸的工艺技术，进一步替代了原有 β-丙氨酸的生产工艺，实现了生物制造 技术工艺的升级和迭代。该技术通过对丙烯酸定向加氨形成 β-丙氨酸，提高了原子 经济性，有效降低了产品成本，体现了高效率、高转化率等巨大优势。

α-熊果苷

熊果苷具有抗炎、抗氧化、平喘等多种药理活性，还是人黑色素细胞中酪氨酸酶的 抑制剂，能够阻断黑色素的形成，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉 积。熊果苷具有α型和β型两种同分异构体，其中α-熊果苷的美白效果是 β-熊果苷的 10倍以上，且α-熊果苷直接抑制酪氨酸酶活性，不抑制人体细胞，是更为高效和安 全的美白剂。 2015年，公司研发团队通过将淀粉蔗糖酶编码基因导入大肠杆菌，用其生产α-熊果 苷转化率可达99%，生产强度达到7.56/g/L。2017年，公司实现了以蔗糖和对苯二酚 为原料酶法生产 α-熊果苷的技术产业化。该工艺以对苯二酚为原料，采用高活性的 糖基转移酶，结合特异分离去除氢醌的提取工艺，可使产品中的氢醌残留低至 1ppm 以下，有效解决了传统工艺普遍存在的酶活低、提取精制成本高、产品杂质含量高等问题，可满足美白化妆品高端用户的需求。