虾青素的合成步骤有哪几步？

在《金城医药（300233）研究报告：医化平台稳步发展，合成生物平台迎新机》报告中，对虾青素的合成步骤进行了详细的研究分析，如果需要更多相关信息，请下载原报告。

1.获取 CrtW 基因和 CrtZ 基因

β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶可以将β-胡萝卜素转化为 终产物 3S-3’S（左旋）型虾青素。合成上述两种酶的基因可以从天然 生产虾青素的藻类和细菌中获取。经过 PCR 扩增、纯化以及根据耶氏 酵母菌的密码子偏爱性进行优化等步骤后，CrtW 和 CrtZ 基因可进入 下一步的整合阶段。 

2.利用 CRISPR/Cas9 操作系统进行基因定点整合

该步骤将 CrtW 和 CrtZ 基因用 CRISPR/Cas9 操作系统或随机整合方法 分开或串联插入到 XK17、IF015、YC607 这三株高产β-胡萝卜素的解 脂耶氏酵母工程菌株的基因组特定位点。CRISPR/Cas9 操作系统可将无 标记基因靶向整合到解脂耶氏酵母基因组的特定位置。该系统将单链 导向 RNA（sgRNA）与 RNA 聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）-tRNA 杂合启动子相结 合，构建用于基因敲除和整合的 CRISPR-Cas9 表达质粒 pCRISPRyl。另 一方面，在解脂耶氏酵母模式菌 Polf 基因组上筛选出多个基因整合效 率较高的位点，构建了带有 hrGFP 表达盒的同源供体质粒 HR Donor。 最终，通过共转化 pCRISPRyl 和重组 HR Donor 实现目的基因的整合。

3.通过随机整合的方法整合目的基因

由于解脂耶氏酵母菌能够高效吸收外源 DNA 片段，也可将七种 CrtW 基因和十种 CrtZ 基因以下图的构建方式随机整合到解脂耶氏酵母的 基因组上。

4.筛选高产菌种

通过摇瓶发酵并测定不同工程菌株的虾青素产量，得到高产候选菌种。 最终，以 IF015 为出发菌株，先后定点插入 CrtZ(A08 位点)、CrtW（XPR2 位点）的产虾青素重组菌 ECA-1 为最优菌种，摇瓶水平的虾青素产量 可达 30-40mg/L。

5.发酵制备虾青素

ECA-1 菌株在特定的发酵培养环境下产出虾青素，实验中最高可达 1.0g/L，且虾青素占类胡萝卜素比例很高，为全左旋的虾青素。