外泌体概念、优势、载药方式及产业进展如何？

最理想的递送载体，成药瓶颈待突破，递送核酸方向布局火热。

外泌体（Exosomes）是细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）中的一种。细胞外囊泡是一类由细胞膜脱落或细胞分泌而成的双层膜囊泡结构，是各种具有膜结构的囊泡的统称，主要包括外泌体，以及微囊泡、微粒、外体、迁移体、肿瘤体和凋亡体等。作为细胞外囊泡的一种主要类型，外泌体是直径为 30-150 nm 纳米大小的膜结构，由天然的人类蛋白质和脂质组成。 包括血细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞等在内的几乎所有类型的细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。因此，外泌体存在于各种生物体液中——不仅能够渗透到组织，还能扩散到血液，甚至穿过血脑屏障（BBB）。 越来越多的研究表明，外泌体在细胞间远距离通讯中起着至关重要的作用：通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控，以实现细胞增殖、分化、免疫调节、炎症调控、细胞凋亡等多种生物学功能。

不同细胞来源的外泌体组成不同，其功能也不同。如树突状细胞分泌的外泌体具有MHC肽复合物，能够激活 T 细胞，还可表达表面配体，如肿瘤坏死因子配体（TNF），Fas 配体（FasL）和 TNF 相关的凋亡诱导配体（TRAIL），从而和肿瘤细胞上的 TNF 受体结合，触发半胱天冬酶活化和肿瘤凋亡。干细胞来源的外泌体包含与 MSCs 类似治疗性的生长因子及mRNA等生物活性物质，具有免疫调节、组织修复等疗效。癌细胞来源的外泌体也发挥免疫调节功能，导致免疫抑制或避免免疫反应。

通过其携带的蛋白质、核酸、脂质和代谢物等，外泌体一方面能够发挥细胞间的通讯功能，另一方面还可以参与免疫应答、病毒感染、代谢和心血管疾病、神经退行性疾病以及肿瘤生长发展等多种生理和病理过程。 由此，人们对外泌体的功能及其作为药物载体的潜在应用产生了极大热情，外泌体因而成为药物载体研发的新热点，以作为新型药物递送载体递送核酸、蛋白质和小分子药物等。

作为天然内源性转运载体，外泌体具有多种先天优势，主要包括： 1）低毒性、低免疫原性、高稳定性：因为是由天然的人类蛋白质和脂质组成，天然外泌体几乎没有免疫原性以及毒性；即使是经过修饰的工程化外泌体，其免疫原性与毒性也非常小。因此，利用外泌体递送可避免外源性的蛋白类、核酸类等药物进入体内被免疫系统识别而遭到清除的情况。由于其内源性，所以外泌体在体内具备高稳定性。虽然与脂质体类似，但是外泌体具有更高的膜曲度和膜不对称性，被证明更利于与细胞膜间的相互作用。

2）空间容量大，能够携带的有效成分类型更丰富：外泌体作为天然细胞间讯息传递载体，富含核酸、蛋白质、脂质等各式不同的生物活性物质，具有较大容量，相对也能包容多种药物分子结构，并具有不同分子转运特性和良好的生物相容性，可以装载许多不同类型的分子和内容物。3）可循环至人体所有腔室，具备较好的组织选择性，可实现靶向递送：不同组织分泌的外泌体，对其组织本身有一种类似归巢性的天然趋向性。如果想靶向不同的组织，利用这种组织分泌的外泌体作为载体，就具有天然靶向性。比如中枢神经系统衍生的外泌体可穿过血脑屏障，利用这一点可克服传统药物难以穿越血脑屏障的弊病，针对脑部疾病开发药物。此外，外泌体表面丰富的蛋白成分，赋予其优秀的识别靶细胞的特性，通过对外泌体表面分子的修饰改造赋予其细胞和组织靶向特异性，可以将外泌体内负载蛋白质/RNA/小分子转运物递送至特定的病理组织器官中去。

因为递送优势巨大，外泌体目前作为热门药物递送系统被广泛研究用于治疗癌症、脑部疾病、遗传性疾病药物及疫苗开发中。外泌体载药方式分为内源性装载（即外泌体产生期间）和外源性装载（即外泌体分离后）。内源性装载是在外泌体形成的生物过程中，亲本细胞产生外泌体之前，通过直接转染、共孵育等方法将目的药物导入外泌体来源细胞，来源细胞再通过生物发生机制产生具有目的药物的外泌体。目前，内源性装载可装载 RNA、蛋白质、小核酸和小分子等不同类型药物。外源性装载是通过电穿孔或脂质体转染等方法将目的药物导入分离后的外泌体中。目前，外源性装载可装载小分子化药、蛋白质、多肽、核酸药物、天然产物等。目前外泌体外源性装载药物方式主要包括直接共孵育、电穿孔、超声处理、转染、挤压、冻融、表面活性剂透化等。 基于不同的载药方式和设计路径，发展出了不同形式用于药物递送的外泌体，主要包括工程化修饰的外泌体和人工合成的外泌体两类。

虽然外泌体在药物递送领域具有诸多优势，但至今还尚未有任何利用外泌体作为递送系统的相关疗法批准上市。这是因为外泌体的临床转化还面临着诸多问题挑战，其中，外泌体分离纯化工艺难度大、难以实现规模化生产、缺乏标准生产和质控方案等是限制其临床应用的主要原因。 外泌体存在于各种体液，大小各异，可以从各种类型的细胞中分离出来，不同来源的外泌体，其组成可能不同。目前根据外泌体的尺寸、理化特性已建立了多种外泌体分离方法（各类方法技术原理及优缺点见下表），主要包括超速离心、超滤、体积排阻色谱、免疫亲和捕获、聚合物沉淀法和微流控技术等，但至今最纯净的外泌体是通过使用蔗糖或碘沙醇通过密度梯度分离方法分离，但这种方法耗时、成本高；其他方法如“金标准”差速超速离心法的设备昂贵，且离心力可能会破坏外泌体的结构和功能，微流控技术分离同样设备昂贵、产量低。可见，现有外泌体的分离技术都存在一定缺陷，难以满足外泌体规模化制备需求。

若外泌体的 CMC 大规模生产问题不能解决，就意味着无法生产出足够数量和质量的外泌体药物来支撑临床需求，那么外泌体就仅能停留在实验室阶段的研发。此外，有产业人士指出，做药最关键的一点在于标准化，需要保证均一稳定的产物，不能有大的批间差。而外泌体大小不一，形状各异，装载物和表达的膜蛋白也各有不同，目前对于外泌体的分离与鉴定、质量控制等环节尚缺乏统一标准，已生产或正在生产中的外泌体也无完整的审批标准。在缺乏标准的情况下，外泌体的产业化无疑面临较大阻碍。其他待优化改进的问题还包括外泌体的靶向递送、载药效率和药物的有效释放等。围绕目前外泌体发展现有局限性，国内外企业进行了努力，部分企业已经获得不错探索成果。如外泌体药物企业龙头 Codiak 已经解决了外泌体的分离纯化和生产放大问题，并找到高分泌蛋白骨架进行药物装载，证明了外泌体递送的有效性。

Codiak 是全球首个建立起 GMP 级外泌体生产工厂的团队，其使用分批补料或连续（灌注）技术在悬浮液中大规模培养细胞以产生外泌体，基于先进的超滤、柱层析、切向流等方法，其生产体系已获 FDA 认可并实现了 3 个药物的 I 期临床推进。Codiak 还找到了两种主要的骨架蛋白——膜外的 PTGFRN 以及膜内的 BASP1，这两种蛋白在 293 细胞系外泌体的表达量极高，且可以作为骨架进行融合蛋白设计。 但或因为外泌体产业研究确实还处于早期，具有较多难以预知的风险挑战，以及公司本身在经营管理层面自己管线立项方面的决策失误，2023 年 3 月，Codiak 申请破产，其exoIL-12和 exoSTING 管线也在 2022 年叫停，外泌体 GMP 工厂则在 2021 年底出售给Lonza 以换取总价值约 6500 万美元的 4 年生产代工服务。目前其 exo-STAT6 管线还得以保留继续推进临床 I 期研究。 国内外泌体产业研究整体处于起步阶段，但也有一些值得关注的初创企业在外泌体载药上探索的较为靠前。

如思珞赛生物对外泌体载药技术进行了全方位的创新研发，开发了具备自主知识产权的程序化药物递送系统（Programmable Drug Delivery）——TAXY™ 系统。TAXY™系统包括：①外泌体高产细胞系 ExoBoos（与现有的工程化外泌体生产细胞系如293SF，Expi293F 等相比，能将外泌体产量提升 20 倍。②外泌体药物高效装载系统ExoPack：该系统能将蛋白质或核酸类药物高效地，选择性地装载到外泌体的内部或者表面。③外泌体靶向改造系统 ExoTarget：该系统利用外泌体进入细胞的不同机制，基于该企业自主研发的支架蛋白(Scaffold)，开发出了不同组织靶向性的外泌体，例如可以靶向脑部、肺部、肌肉等组织。④外泌体胞内释放系统 ExoRelease：该系统基于外泌体进入细胞后的循环途径，针对性地对外泌体进行改造后，能够大大提升药物的有效释放。

此外，思珞赛生物参照国内外外泌体协会的指导意见和相关行业标准，结合自身研究经验，明确了外泌体 GMP 级别大规模生产的工艺流程和产品放行的质控指标。并且已经具备制备从实验室级别（<2L）放大到工业级别外泌体（200L）样本量的能力。诸如茵冠生物在内的企业也在外泌体技术及平台建设方面也取得了国际领先的突破，开发了包括外泌体规模化制备技术(winExm)、药物偶联技术（winLiK）、靶向修饰技术（winExt），拥有 10 余项突破性的专有技术，建立了规模化外泌体制备体系，多批次产品质量优异稳定，各项指标优于团标且纯度较高。 恩泽康泰打造了基于核心知识产权的工程化外泌体平台 Echosome 以赋能外泌体创新药研发，现已建成 3000 平米外泌体 GMP 中试车间，并且建立成熟的外泌体生产工艺和质量表征体系。 目前基于 Codiak 的 exo-STAT6 管线在临床 1 期探索的不错数据，国内大部分研究外泌体载药的企业也纷纷布局外泌体在核酸药物方面的递送，如唯思尔康、艾码生物等。