基因编辑治疗路径有哪些？

基因编辑治疗根据基因编辑发生的场景主要分为 2 条路径：体内（in vivo）和体外（ex vivo）。

1.体内基因编辑 – 基因敲除

结构与机理

体内基因编辑是指将基因编辑工具递送进入人体，在人体中对致病基因进行编辑处理的治疗方式。 从编辑方式来看，可分为敲除（knock-out）和敲入（knock-in）两种模式，也可同时进行敲除和敲 入。敲除，顾名思义，即是将某些错误表达或过度表达的基因进行抑制，使得患者身体不再继续生 产错误的蛋白。相反，敲入则是将患者缺失的基因递送进入体内，使患者能够正常生产之前缺失的 蛋白。相较于敲除，敲入的技术难度较高，目前进度也相对滞后。从技术角度来说，敲入包含了敲 除所需的所有技术步骤，同时还需要额外的插入技术。因此，本章节中将主要介绍敲除，在下一章 节简单介绍敲入。

目前这一路径的领导者是诺贝尔奖得主、UC Berkeley 教授 Jennifer Doudna 作为共同创始人的 Intellia Therapeutics。以 Intellia 的管线之一 NTLA-2002 为例，以此窥探体内基因编辑疗法的大 概原理。 NTLA-2002 的有效成分由脂质微粒（lipid nanoparticle，LNP）包裹，以内含体（endosome）的形式 进入细胞。药物有效成分主要由 2 种分子组成：靶向目标基因序列（此处 NTLA-2002 中，即 KLKB1 基因）的 guide RNA（gRNA），以及编码 Cas9 的 mRNA。Cas9 mRNA 在进入细胞质后被 核糖体翻译为 Cas9 蛋白。Cas9 蛋白与 gRNA 形成结合体，并进入细胞核。gRNA 将结合体引导至 设定的基因序列，Cas9 对其进行切割。由此，致病基因不再能够产生致病蛋白。

永久纠正致病基因

由于体内基因编辑直接作用于人体 DNA，因此其对基因的纠偏将被存储于人体的遗传信息中。细 胞分裂后的子细胞将会继承编辑后的 DNA。因此，通过一次高效的基因编辑，致病基因有望永久 被纠正。 这一特征已在 Intellia 的两个产品管线中体现。NTLA-2001，用于治疗由转甲状腺素蛋白淀粉样变 性（ATTR）造成的神经疾病和心肌疾病，只需 1 次给药，便可使蛋白淀粉样沉淀长时间维持较低 水平。 Intellia 表 示 其 有 潜 力 在 患 者 一 生 的 时 间 内 稳 定 抑 制 TTR （ “ lifelong, stable TTR reduction”）。另一管线，NTLA-2002，用于治疗遗传性血管水肿（HAE），同样也只需 1 次给药， 从目前的临床研究患者跟踪来看，药效明显且持续。 由于 1 次给药即可发挥持久的药效，基因编辑疗法无需冗长繁琐的疗程，有望明显提高患者的 依从性。

精确靶向致病源头

由于 CRISPR 对基因序列的识别具有较高的精度，因此体内基因编辑治疗能够精确靶向致病基因， 而不影响人体其他机制的正常工作。

LNP 递送已得到验证

体内基因编辑疗法的主要作用成份是 2 种 RNA，因此需要进入细胞后才可发挥作用。目前针对 RNA 疫苗及药物，最主要的递送系统之一便是脂质纳米微粒（LNP）。LNP 递送系统在本次新冠 mRNA 疫苗中已获得了较为充分的验证。 LNP 由 4 种主要成分构成：可阳离子化脂质（cationic ionizable lipid）、中性脂质、胆固醇、PEG。

其中，可阳离子化脂质是核心成分，它深刻影响着 RNA 递送进入细胞后的释放。在进入细胞前， 可阳离子化脂质在常规的生理环境下呈中性。包裹 RNA 药物成分的 LNP 抵达细胞后，以内含体 （endosome）的形式进入细胞。由于内含体内部环境逐渐酸性化（endosomal acidification），可阳 离子化脂质质子化（protonate），与中性脂质互相作用，破坏原本 LNP 以及内含体的结构，使得 RNA 能够逃离，进入细胞质内。因此，一个优秀的可阳离子化脂质以及 LNP 结构能够在药物进入 细胞前稳定 LNP 结构，保护运载的 RNA；在进入细胞后，又能够充分打开包裹，使得 RNA 能够 充分地释放到细胞质中，以实现较好的药效。

LNP 能够递送较大分子量的药物成分进入细胞。因此，能够较好地包裹 gRNA 和 Cas9 mRNA。 LNP 具有生物降解性。因其主要构成成分为脂质，可通过人体正常的代谢活动降解，对人体造成的 负担有限。 LNP 安全性较好。相对于其他递送系统，例如病毒载体，其本身的免疫原性较低，因此不易引起免 疫系统过度反应。 LNP 规模化生产相对简单，放大生产难度低，同时已有 mRNA 疫苗大规模生产的产业经验。 LNP 可通过外层结构设计，来靶向特定的器官或细胞种类。 除技术方面外，使用 LNP 目前面临的一大挑战是专利问题。目前最常见的规避专利的方法是自主 设计可阳离子化脂质的分子结构。这对研发团队在生物化学及分子生物学的素养提出了较高的要求。

安全风险仍是重中之重，风险获益比是适应症选择的关键

由于 CRISPR-Cas 基因编辑系统的底层运作必须经过双链断裂（DSB，double-strand breaking），而 DSB 对于基因而言是一个较大的变动，其本身可控性较差，难以预测可能造成的结果，带来了肿瘤、 免疫疾病的风险。相较于体外基因编辑可以通过质量控制来掌控进入人体的编辑产物，体内基因编 辑无法进行类似的质量控制，因为体内基因编辑是将编辑工具送入人体内，在人体中完成编辑工作， 因此，若出现脱靶事件，错误编辑的细胞仍会留在体内。 因此，相较于体外基因编辑，体内基因编辑的安全风险更大，这也将是这类疗法面临监管审批时最 大的挑战。因此，适应症的选择非常重要。在安全性未确定的情况下，未被满足的医疗需求，尤其 是目前尚未有有效疗法，生存期较短和生存概率低的病症，可能是体内基因编辑治疗较好的选择。

2.体内基因编辑 – 基因敲入

设计和技术原理

如上文所述，体内基因编辑相较于体外基因编辑难度更高，而体内基因编辑中，基因敲入比基因敲 除难度更高。因此，基因敲入所需掌握的技术复杂，要求高。因此目前进展也落后于其他路径。 从步骤上来看，基因敲除通过 CRISPR 系统 gRNA 和 Cas 在特定位点剪切 DNA 链，造成双链断裂 （DSB），使靶点基因无法正常表达。根据 Intellia 的设计思路，基因敲入同样需要 CRISPR 系统先 剪切 DNA 双链，再通过病毒载体（Intellia 目前使用的是腺相关病毒 AAV 作为载体）在剪切位置 插入缺失的基因。 因此基因敲入由 2 个部分组成。第一部分由 LNP 作为递送系统包裹用于定位的 gRNA 和编码 Cas （用于切割）的 mRNA，在设定位点进行切割。第二部分由病毒载体作为递送系统，将患者缺失的 基因递送进入细胞核，并整合进患者基因中。

AAV 可将希望递送的基因片段包裹进病毒载体颗粒。病毒载体经细胞表面的受体识别，由内含体 （endosome）包裹进入细胞内。进入细胞后，部分病毒颗粒从内含体逃逸至细胞质内，部分病毒颗 粒则跟随内含体到达溶酶体（lysosome）后再逃逸进入细胞质。随后，病毒颗粒进入细胞核，并褪 去外壳，将携带的基因释放出来。

在上一步中，gRNA 和 Cas 蛋白已在 DNA 上的特定位点进行了剪切。细胞的修复机制会试图将断 裂的 DNA 重新连接在一起。常见的修复机制有两种，HDR（homology-directed repair，同源介导修 复）和 NHEJ（non-homologous end-joining，非同源末端接合）。实现基因敲入需要 HDR 修复，而 NHEJ 无法帮助实现基因敲入。 HDR：是最为重要且常见的修复方式，同时也是实现基因敲入所需要的修复方式。HDR 通过模版 序列来修复断裂的部分。模版序列可来自另一条姊妹染色体也可来自外部引入的 DNA 模版。模版 序列的特征是拥有和断裂 DNA 两端相同的序列。HDR 修复机制会根据模版序列将断裂部分填补上， 因此，若以姊妹染色体作为模版序列，断裂的 DNA 将被恢复成原样；若以外部引入的序列作为模 版，修复后的 DNA 将包含模版中间的序列。因此，设计的序列将在两端包含 DNA 断裂两侧的序 列，中间则是希望敲入的基因序列。在通过 AAV 将序列递送进入细胞核后，便可作为模版序列供 HDR 对 DNA 进行修复，修复后的 DNA 便包含了希望敲入的基因。

NHEJ：作为最主要的 DNA 双链断裂的修复方式，本身具有较大的不确定性，在修复后常常会引 入不同种类的突变（插入、删除、替换），因此可能会产生框架漂移，导致错误的基因表达。由于 基因突变通常会抑制基因的正常表达，因此 NHEJ 一般能够在基因敲除中发挥作用。但在基因敲入 方面，则不希望出现 NHEJ，因为 NHEJ 重新连接断裂 DNA 的序列是不确定的。

HDR 修复机制是合适的修复种类，因为 HDR 可能采用利用 AAV 病毒载体递送进来的基因物质作 为模板，对断裂的 DNA 进行修复。 NHEJ 是不合适的修复机制。因为 NHEJ 修复仅仅将断裂的 DNA 连接起来，但如何连接是随机的。 NHEJ 不仅不会按照 AAV 递送的模板基因序列进行修复，还有可能引入其他突变。 因此，如何使细胞尽可能多地采用 HDR 修复，是目前研究的关键点之一。

DNA 修复机制不确定性较高

DNA 双链断裂（DSB）的修复具有较高的不确定性。不确定性主要来自 2 方面：修复方式的选择 和修复方式本身的随机性。 首先，如上文所述，DNA 双链断裂的修复机制主要是 HDR 和 NHEJ。其中，只有 HDR 有可能实 现基因敲入；NHEJ 无法实现敲入，相反，NHEJ 常常引入更多不确定的突变，例如：插入、删减、 替换，有可能造成框架漂移，引起肿瘤或其他疾病。因此，在 CRISPR 系统引入双链断裂后，希望 人体尽可能多地使用 HDR 作为修复方式，并尽量减少 NHEJ 的发生。但是，细胞会选择哪一种修 复方式是不确定的，并且，修复方式的选择受多种因素影响。

在一项发表在 Nature 的研究中，来自 Bio-Rad 和 UCSF 的团队试图量化 HDR 和 NHEJ 发生的比例， 并找到增加 HDR、减少 NHEJ 的变量。研究发现，影响 HDR 和 NHEJ 发生比例的因素多种多样， 例如基因编辑工具的种类、Cas 蛋白的选择、gRNA 的组合、方向、细胞种类、编辑位点等，都会 对 HDR 和 NHEJ 的占比产生影响。 因此，针对不同适应症、不同基因位点、不同细胞种类，基因敲入治疗所需的 gRNA、Cas 蛋白、 AAV 序列等成分均需要新设计，同时进行排列组合，找出最佳搭配。在初始阶段，这一过程需要 大量的实验验证，研发时间长，因此，如果能够成功，行业领军者将获得明显的先发优势护城河。 当实验数据的积累足够充分后，后续的研发有望逐渐提速，因此，先发者的先发优势将有可能逐渐 扩大。

不确定性还来自于 HDR 机制本身。虽然相较于 NHEJ，HDR 被认为是较为精准、不易出错的修复 方式，但仍有可能因为基因重组反应（recombination）产生突变。 综合以上两点，对于基因敲入至关重要的修复机制却有不可忽视的不确定性，这对于最终基因编辑 能否正确成功完成提出了挑战。

AAV 设计复杂，运载能力有限。

AAV，Adeno-associated virus，腺相关病毒，是一种单链 DNA 病毒。自然界中，AAV 在许多脊椎 动物中被发现，但目前普遍认为 AAV 并不会引起人类疾病。AAV 衣壳呈二十面体，直径约 26 nm， AAV 的基因组由正向或反向的单链 DNA 构成，长度约 4.7 kb，这也基本决定了 AAV 被改造为递 送载体后它的载荷大致在这一水平。AAV 基因组两侧分别有 1 个 ITR（inverted terminal repeat）作 为侧翼，ITR 呈 T 形，在病毒复制与包封过程中起重要作用。 AAV 作为载体时，将编码病毒蛋白的基因组去除，并用递送的基因序列代替。 AAV 的载荷在 4.7 kb 左右，这其中除希望表达的基因外，部分情况下还包含调节表达的序列，例 如启动子（promoter）。因此，AAV 能够递送的基因材料相对有限。

人体免疫屏障可能降低 AAV 递送效率

AAV 递送可能会受到多种、多层人体免疫系统的抵抗，导致递送效率降低。 中和抗体：感染自然腺相关病毒后产生的中和抗体在人体中循环。中和抗体能够识别 AAV 类病毒 的衣壳，因此不仅靶向自然 AAV，也靶向重组 AAV。目前，有研究团队正在探索衣壳改造的方法， 以规避免疫系统的检验，但目前还处于早期阶段。除此之外，也有空衣壳诱饵、血浆去除等其他策 略正在研究中。 另外，病毒衣壳还有可能诱导 T 淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）免疫，AAV 成功转化的 细胞将可能受到攻击，导致成功进行了基因编辑的细胞被杀死。虽然相较于其他病毒载体（例如腺 病毒载体），AAV 诱导的 CTL 强度较低，但仍然影响整体递送效率和基因编辑治疗的有效性。

特点 1：体内基因编辑有望实现“一次给药，永久治愈”。 特点 2：相较于体外，体内基因编辑对技术的精准性和可靠性要求更高，因为基因编辑发生在人体 内，所以无法通过质量控制环节筛除编辑失败的细胞。 特点 3：体内基因编辑主要可分为基因敲除和基因敲入。其中基因敲入环节更多，需要掌握的技术 也更多，目前基因敲入进展也较慢，尚未有产品进入临床阶段。 特点 4：基因敲除通常使用 LNP 递送系统运输 CRISPR 编辑工具进入体内，基因敲入不仅需要 LNP 递送编辑工具，还需要递送修复模版（通常使用病毒载体 AAV 作为递送系统）。 特点 5：这一细分市场，参与者较少。目前 Intellia Therapeutics 拥有较明显的领跑优势。

3.体外基因编辑

体外基因编辑助力细胞治疗 相较于体内编辑，体外基因编辑是竞争者较多的细分赛道。主要原因是体外基因编辑可以通过质量 控制保证基因编辑的质量，将不达标的细胞去除，从安全性的角度来看更为可靠，也更容易被监管 机构所接受。 从某个角度来说，体外基因编辑是利用基因编辑工具赋能细胞治疗。目前的细胞治疗，受制于细胞 免疫机制，以自体型为主。但自体型细胞治疗的缺陷也较为明显： 首先，由于所有细胞均来自于患者自身，因此成本较高，也无法规模生产，导致价格一直居高 不下。 第二，由于每个患者接受的细胞治疗都是个体化产品，因此制备所需时间较长。同时，治疗过 程较为繁琐，对患者的生理和心理的消耗较大。 由于自体型细胞治疗有着上述的种种缺陷，通用型（Allogeneic）细胞治疗吸引了大量关注。相较 于自体型细胞治疗，通用型细胞治疗的优势在于： 可以提前制备，不需患者等待。 环节减少，不需要从患者体内提取细胞，减少患者负担。 产品一致性更佳，因此有望实现规模化生产，成本可能降低。 但挑战也随之而来，自体型细胞治疗最大的障碍便是降低免疫排异反应。

多种人体免疫机制限制细胞治疗

排异反应来自多个人体免疫机制，例如 T 细胞和 NK 细胞（与 HLA 基因相关）。同时，若输注的 治疗细胞量较大的话，输注细胞可能会对人体细胞产生排异（与 TCR 相关）（GvHD）。

基因编辑改造细胞，尽量避免不需要的免疫机制

通过基因编辑，尽量干扰或阻断引起排异反应的信号通路。

Intellia 在此提供了一些可能的改进思路。例如：通过敲除治疗细胞的 TCR 来避免移植物排斥宿主 病（GvHD）；通过基因敲入引入 CAR 或 TCR 来增强细胞对肿瘤的杀伤；敲除 II 型 HLA 基因来 避免 CD-4 介导的排异反应；敲除 HLA-A 来避免 CD-8 介导的排异反应；调整 HLA-B 和 HLA-C 来 避免 NK 细胞介导的排异反应。

CRISPR Therapeutics 第一代体外基因编辑产品设计也遵循类似的设计理念：通过敲除 β2M 来去除 MHC1 的表达，使 CAR-T 细胞不容易被患者的免疫系统识别；通过干扰 TCR 的表达，使 CAR-T 细胞不再排斥患者体内的细胞；利用 CRISPR 技术，将 CAR 序列精准插入至 TRAC 位点，提高一 致性和安全性。

基因编辑改造细胞，加强对肿瘤细胞的杀伤力

通过基因编辑，除了可以干扰或阻断引起排异反应的信号通路，也可以增强治疗细胞的有效性。 CRISPR Therapeutics 第二代体外基因编辑产品是针对肿瘤的一款细胞治疗，产品设计在第一代基础 上继续改进：通过干扰 Regase-1 的表达，使细胞素分泌增加，增强对肿瘤细胞的毒性；敲除 TGFBR2，使 CAR-T 细胞对肿瘤细胞分泌的 TGF-β 不再敏感，加强杀伤。

CRISPR Therapeutics 第一代体外基因编辑产品的设计主要利用基因编辑技术增强了产品的安全性， 避免不必要的免疫排斥。第二代体外基因编辑产品设计在第一代基础上的改进主要是为了增强工 程细胞对肿瘤细胞的杀伤力。对不同基因的编辑，给细胞治疗带来了更大的设计空间，更多的改 进方向。

寻找合适的策略和编辑位点，考验研发机构对细胞机制的理解水平

基因编辑提供了有力的改进细胞治疗的方法和工具箱。如何利用好基因编辑，使基因编辑发挥最大 的效益，考验研发团队对细胞机制的理解水平。 CRISPR Therapeutics 提供了一个范例。CRISPR Therapeutics 的研发人员们发现，CAR-T 细胞不需 过长的体内留存时间。CAR-T 细胞在人体内的 PK 特征呈现较明显的 3 个阶段。第一阶段 CAR-T 细胞寻找肿瘤所在的靶点；第二阶段 CAR-T 细胞开始扩增，攻击肿瘤细胞；第三阶段，CAR-T 细 胞被自身免疫系统清除。研究发现 CAR-T 细胞进入体内后便内快速响应，一般不需留存 28 天便能 实现持续的病情缓解。此外，NK 细胞未在肿瘤处聚集，意味着继续降低 CAR-T 免疫原性的收益不 高。因此，研发团队转向寻找提高有效性的方案。

体外基因编辑特点

特点 1：相较于体内，体外基因编辑安全性、可控性更佳。 特点 2：许多体外基因编辑管线可以看作是细胞治疗的升级，是使用基因编辑技术赋能细胞治疗， 改善治疗细胞的免疫原性、提高安全性、增强针对肿瘤细胞的杀伤力（若适应症为癌症）。 特点 3：针对不同适应症，可进行不同的设计，使治疗细胞的不同能力得到加强。 特点 4：基因编辑提供了大量细胞治疗升级的可能性，但哪些方向、策略最有价值，非常考验研发 团队对细胞机制的理解和积累。AI 在其中可能能够提升筛选效率。 特点 5：CRISPR Therapeutics 与 Vertex 合作开发的 Exa-cel 有望成为首个获批的基因编辑疗法。该 产品用于治疗 TDT 和 SCD 的上市申请已于 2023 年 1 月获 EMA 受理，于 2023 年 4 月 3 日完成了 向 FDA 提起的 BLA。Exa-cel 已获得 FDA 授予的 RMAT、快速通道、孤儿药认证，和 EMA 授予 的优先药物（PRIME）认证。